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牛磺鹅去氧胆酸钠的提取及其药理作用比较
新闻详情:

      摘要:以500mL鸡胆汁为基本原料,采用沉淀、过滤、减压蒸馏、真空干燥、抽提、重结晶法,制得了712g结合型的牛磺鹅去氧胆酸钠(TCDCANa),以TLC及IR法确定其结构。并将其与鹅去氧胆酸钠(CDCANa)进行镇咳、平喘和祛痰作用对比实验。药理实验结果为:TCDCANa和CDCANa的镇咳作用减咳率分别为(2911±516)%和(1812±618)%;平喘作用解痉率分别为(7919±2218)%和(7313±2217)%,祛痰作用酚红排泌量分别为(11601±01391)μg/mL和(11029±01308)μg/mL,TCDCANa与CDCANa间存在显著性差异(P<0101)。
      药理实验结果表明:TCDCANa具有明显的镇咳、平喘、祛痰和抗炎作用,其作用强于CDCANa。
      关键词:鸡胆;牛磺鹅去氧胆酸钠;药理作用;中药现代化技术;

      牛磺鹅去氧胆酸钠是鸡、鸭等家禽类动物胆汁中的主要胆汁酸成分,也是蛇胆汁中的主要胆汁酸成分之一,是一种重要的生化药物。以往报道的胆汁酸药理作用,大多以游离型胆汁酸盐为研究对象,实际上新鲜的动物胆汁中,几乎不含游离型的胆汁酸盐,若保存方法不当或肝胆疾病,可使结合型的TCDCANa分解为游离型的CDCANa。传统的提取工艺首先将家禽胆汁皂化,经酸化、脱脂、沉淀等步骤后,得到游离型的鹅去氧胆酸(chenodeoxycholicacid,CDCA),该法收率低、步骤多、工艺复杂,难以得到大量纯度较高的成品,且不能得到结合型的TCDCANa。TCDCANa由于亲水性强,不易从胆汁中分离提取,故限制了其药理作用的研究。

      1 材料
      1.1.1 试剂及药品乙酸乙酯、乙醇、乙醚、氯仿、甲醇、冰醋酸、正丁醇均为AR;薄层硅胶G(60型),青岛海洋化工厂生产;牛磺鹅去氧胆酸对照品购自美国Sigma公司;鹅去氧胆酸,生物制品,购自上海广茂生化制品有限公司;新鲜鸡胆汁购自武汉市竹叶山杀鸡场。
      1.1.2 动物
      小白鼠(昆明种)体重(18~22)g,购自华中科技大学同济医学院动物实验中心,雌雄兼用,饲养室温(25±2)℃,按性别分笼,自由饮水和进食。
      1.1.3 仪器
      LMS-2A型二道生理记录仪;721型分光光度计;FTIR红外光谱仪(SpectrumOne,Perking2ElmerCo.,America)。

      2 方法
      2.1.1 牛磺鹅去氧胆酸的提取和纯化取新鲜鸡胆汁500mL,加入3倍体积的w(C2H5OH)=95%的乙醇,搅拌30min,静置24h,过滤。滤液减压蒸干(≤50℃),然后置真空干燥器抽真空干燥2d,即得鸡胆粉。将鸡胆粉用V(乙酸乙酯)∶V(无水乙醇)=8∶2的混合液,以索氏抽提器提取30次,冷却提取液,得浅黄色固体,过滤,沉淀用无水乙醚洗涤,置真空干燥器中干燥4h,用无水乙醇重结晶,得浅黄色TCDCANa结晶712g。
      TLC检查:硅胶G为吸附剂,以质量浓度为1mg/mL的样品MeOH液点样5μL,以V(氯仿)∶V(甲醇)∶V(水)=65∶28∶4混合液为展开剂,展开15cm,喷洒w(磷钼酸)=5%的乙醇溶液,110℃烘烤10min显色。
      IR检查:以KBr压片制样,FTIR红外光谱仪(SpectrumOne,Perking2ElmerCo.,America)室温扫描。
      2.1.2 牛磺鹅去氧胆酸钠的药理作用[7]
      用上述方法提取得到的TCDCANa,质量分数达92%以上,其药理统计学方法采用t检验分析。
      2.1.2.1 镇咳作用
      采用浓氨水引咳法,选取(20±2)g健康小鼠,雌雄各半随机分组。将小鼠放于密封的钟罩内,用玻璃雾化器喷入浓氨水,1min后,立即取出小鼠,置烧杯内观察,以小鼠腹肌收缩,张口为咳嗽指标,记录1min内咳嗽次数(无咳嗽或咳数少于30次的为不敏感,弃之),立即灌胃给药。空白对照组给生理盐水015mL/只;阳性对照组给可待因注射剂015mL/只;实验组分别给TCDCANa和CDCANa水溶液(质量浓度为10mg/mL)015mL/只。1h后,依上法再次给予氨气刺激,记录给药后的咳嗽次数。
      2.1.2.2 平喘作用
      选取(300±20)g健康豚鼠,随机分组。急性处死后,剪下自甲状软骨下至气管分叉处的一段气管后,在通以V(O2)∶V(CO2)=95∶5混合气体的38℃克氏液中,细心剥离气管周围结缔组织。将气管软骨环间横切为5~6段,用棉线将各段结扎成链状。将此标本置于盛有38℃克氏液的浴管中,连通二道生理仪。当气管链基线稳定后,向20mL浴管中注入3×10-5mol/L乙酰胆碱(Ach)011mL,促使气管链痉挛收缩。当气管链收缩幅度达到峰值时,加供试液。空白对照组给生理盐水1mL,以w(氨茶碱)=5%的水溶液014mL为阳性对照(Aminophylline),实验组分别给80mg/mL的TCDCANa和CDCANa的水溶液1mL。观察它们对Ach的抵抗作用。
      2.213 祛痰作用
      选取(20±2)g健康小鼠,随机分组。分别灌胃给药,2次/d,连续3d,实验前先将小鼠禁食12h,只供饮水。空白对照组给生理盐水015mL/只;实验组分别给10mg/mL的TCDCANa、CDCANa水溶液015mL/只。最后一次给药015h后,皮下注射215g/L的酚红溶液014mL/只。又过015h,将小鼠颈椎脱臼致死,仰位固定于木板上。切开颈正中皮肤,找出气管,在其下穿一根线备结扎用。将6号针头从小鼠喉头刺入气管013cm。用1mL注射器抽取50g/L的NaHCO3水溶液014mL,抽洗3次,将冲洗液注入小试管中。如此再重复操作4次,将5次冲洗液混合,并用ρ(NaHCO3)=50g/L的水溶液稀释至3mL,1500r/min离心分离。5min后,小心分取上清液,于波长540nm处,以ρ(NaHCO3)=50g/L的水溶液为空白,进行比色,将所得吸光度代入酚红标准曲线回归方程[1],求出小鼠气管酚红排泌量。

      3 结果与讨论
      3.1.1 TCDCANa的提取及结构表征作者以新鲜或冷冻鸡胆汁为原料,经沉淀、过滤、减压蒸馏、真空干燥得鸡胆粉,然后将鸡胆粉以乙酸乙酯-无水乙醇混合溶剂为提取液,在无水环境下抽提,制得TCDCANa粗品,经无水乙醇重结晶,制备了TCDCANa,经TLC检测,除主斑点之外无其他可见斑点,且Rf值与对照品TCDCANa(Sigma公司产品)一致,表明其w(TCDCANa)≥92%。
      3.1.2 TCDCANa与CDCANa的药理作用比较动物性药物是中药的重要组成部分,具有资源丰富,疗效好的特点。在新药开发研究中,人们已倾向于应用现代生化实验技术手段从动物性药物中分离提取出各种有效成分,并对其药理作用进行深入细致的研究。
      3.1.2.1.1 镇咳作用比较作者以浓氨水引咳法,将TCDCANa与其游离型CDCANa进行了镇咳作用比较。镇咳作用以减咳率表示。
      3.1.2.1.3 祛痰作用
      祛痰作用采用酚红排泌法,结果表明,TCDCANa、CDCANa均能显著增加小鼠气管酚红排泌量(P<0101),且TCDCANa比CDCANa作用强(P<0101),显示TCDCANa比CDCANa有明显的祛痰作用。

      4 结论
      本文以新鲜鸡胆汁为原料,经沉淀、过滤、减压蒸馏、真空干燥、抽提、重结晶等步骤,未经色谱法提纯,即可制得TCDCANa,质量分数≥92%。药理实验对比研究结果表明,TCDCANa和CDCANa均具有明显的镇咳、平喘和祛痰作用,且TCDCANa的作用强于CDCANa。鸡胆、蛇胆、熊胆等天然胆汁中主要含结合胆汁酸,游离胆汁酸含量极微或没有,本研究结果提示,这些动物胆汁对镇咳、平喘和祛痰起主要作用的是结合胆汁酸。胆汁酸盐是一类表面活性剂,当其分子中结合了水溶性氨基酸后,亲水性明显增强,其表面活性也相对增强,它对生物膜的通透性及膜的表面结构将产生更大的影响。

宝积生物•胆汁酸专家 0571-88604801